如何通过化学修饰提高mRNA的稳定性和效率？

德国科隆大学的研究人员提出了一种对mRNA进行双重化学修饰的策略，并评估了这些修饰对mRNA功能的影响。

从感染性疾病到癌症再到各种罕见疾病，mRNA在各种疾病中都显示出潜在的治疗价值。

然而，mRNA分子不稳定，易降解，通常需要对mRNA天然碱基进行修饰，如capping, tail, modification和replace。

例如，两种正式推出的病毒mRNA疫苗的mRNA分子都进行了不同程度的特殊修饰。

这些特殊修改的效果如何?这也是科学家需要深入研究和解决的问题。准确定量的鉴定mRNA的修饰位点和修饰方法是深入分析mRNA修饰功能和机制的前提，也为提高mRNA的稳定性和效率提供了新的方向。

德国科隆大学的研究人员提出了一种对mRNA进行双重化学修饰的策略，并评估了这些修饰对mRNA功能的影响。

在这项研究中，该团队在mRNA转录过程中引入了第三个碱基对，将非自然的核苷酸引入到特定的位点，同时结合自然的mRNA修饰方法。

研究发现，双化学修饰的mRNA可以形成协同效应，提高mRNA的稳定性、效率和蛋白表达。

本团队利用该方法对mRNA进行标记，并进一步研究了人工修饰核苷酸对mRNA效率和稳定性的影响。

“我们研究了这种化学修饰的mRNA在细胞中的稳定性，合成的mRNA是否可以用作细胞中高效蛋白质生产的模板，以及化学修饰对翻译成蛋白质的影响"，肖尔教授说:“研究结果表明，这种新方法在监测mRNA进入细胞、监测和影响其在细胞水平的传播以及信息转录的效率方面非常有效。"

该研究成果已被《Chemical Science》杂志接受。

这项研究是由科隆大学有机化学研究所的斯蒂芬妮·卡特-肖尔教授领导的，她从2020年开始在科隆大学化学系担任教授。

实验室主要研究方向为核酸化学和化学生物学，包括功能RNA-核酸化学修饰、催化RNA和非编码RNA功能研究。

根据研究小组的说法，这种方法有望为开发更有效的mRNA疗法开辟新的可能性。

双化学改性，达到协同增效

目前，有多种修饰技术可用于产生更稳定的mRNA，大致可分为三类：用人工合成的非天然核糖核酸代替天然核糖核酸合成mRNA；添加5′caps、3′poly（A）“尾"和UTR（未翻译区）序列；并采用特殊的新型配方技术，有效保护mRNA。

其中，人工合成非天然核糖核酸取代天然核糖核酸合成mRNA是较为常用的方法之一。真核mRNA上的化学修饰大致可以分为三类:甲基化、伪尿苷(Ψ)和次嘌呤。

经过研究和工业应用，该方法可以降低mRNA固有的免疫原性和不稳定性。例如，Moderna和BioNTech的mRNA疫苗都使用伪尿嘧啶修饰来维持mRNA的稳定性。

随着mRNA治疗的不断发展，学术界和工业界一直在寻找更多的改进方法，以提高mRNA的效率和稳定性。深入分析这些修饰对mRNA的功能影响，是控制mRNA结构、提高其稳定性和翻译活性的重要基础。

为了进一步研究这些化学修饰对mRNA的影响，Stephanie kat - schorr的团队提出了结合位点特异性插入合成核苷酸和自然碱基修饰的想法。

在他们的实验中，通过在DNA到RNA的酶转录过程中引入第三个碱基对，他们在3 ' -UTR处插入了合成的核苷酸，包含了Ψ和5mC(甲基化修饰)。，并设计了一系列实验来观察、量化和验证mRNA的功能。

重要的是要注意,引入合成核苷酸通过基因转录(GENAEXT)字母扩张建立在以前的工作由各自的团队一郎Hirao弗洛伊德Romesberg,他在2018年发表的研究指出,不自然的碱基对可以转录精度高、效率高。

在此基础上，通过将功能化的非自然核苷酸具体引入长mRNA片段进行了改进。

在这项研究中，科隆大学团队在体外合成了功能化和编码蛋白质的GENAEXT mRNA，其中包括CP修饰，可以编码红色荧光报告蛋白mCherry。

具体包括在3 ' -UTR区域插入环丙烯(CP)， mRNA上Ψ和5mC修饰以提高其活性，以及引入5 ' cap和3 ' tail修饰。

然后，将修饰后的mRNA通过脂质体转染到哺乳动物细胞中，通过逆转录定量PCR (RT-qPCR)分析mRNA水平和mCherry报告基因的表达，并与cp修饰的GENAEXT mRNA与未修饰的mRNA的翻译效率进行比较。

数据表明，经过双重化学修饰方法(自然碱基修饰和CP非自然碱基对插入)的mRNA在细胞内翻译可以产生协同效应，这种合成的mRNA可以增加蛋白表达，提高转染效率、有效性。

此外，cp修饰的mRNA在活细胞中通过反电子需求Diels-Alder (iEDDA)反应进行荧光标记。

用四嗪荧光团衍生物对合成的mRNA进行iEDDA处理后，研究人员可以通过共聚焦荧光显微镜观察活细胞中的mRNA，同时也可以在时间和空间上跟踪mRNA。

iEDDA:一种无催化剂的点击反应(环加成反应)，具有生物相容性好、反应特异性高、反应速度快、毒性低等优点。

为了评估mRNA转染过程中的细胞状态和活细胞中的click反应，他们还进行了细胞活力测定。

释放更多的mRNA潜能?

事实上，从mRNA序列进入细胞到引导细胞分泌蛋白质的过程存在许多困难，包括在进入细胞之前被无处不在的RNAse水解成小核苷酸分子;稳定表达,等等。

如前所述，利用人工合成的非天然核苷酸取代天然核苷酸合成mRNA已经是常用的mRNA修饰方法之一。

同时，通过在特定的mRNA片段中引入人工合成的非天然核苷酸，证明了修饰mRNA的可行性。在本研究中，该团队将这两种方法结合起来，提高了蛋白质合成效率和转染效率。

因此，研究团队认为，他们的实验结果表明，GENAEXT方法的使用将为mRNA修饰的研究提供新的思路。

“这种方法可能为mRNA修饰开辟新的可能性微调mRNA的特性，并通过共价载体系统将mRNA高效传递到细胞中，"该团队指出，他们已经通过一系列的研究表明，原则上，GENAEXT方法可以应用于任何长度的mRNA序列，而与四嗪衍生物的iEDDA click反应将使mRNA更功能化。

此外，该团队认为，通过在mRNA的非翻译区引入人工调节元件，调控mRNA翻译水平的潜力可能被解锁。

同时，他们提到，该方法除了能够在细胞实验中附着各种报告基团外，还具有应用于体外蛋白质结合实验以鉴定mRNA结合蛋白的潜力。

此外，该团队提出的方法还将为检测修饰后mRNA的稳定性和表达效率提供一个新的“把柄"。目前，科学家们已经在定量和高通量两个方向开发了多种方法。

更常用的方法包括通过结合特异性抗体的高通量富集，化学小分子/化学小分子衍生物的富集，以及特殊性质。测序技术。

对于下一个计划，研究小组表示，他们正在开发更有效地包装mRNA的方法，以更好地保护mRNA，使其顺利进入细胞。