重组DNA的构建（载体构建）

基本原理：
    外源目的DNA与载体分子的连接称为DNA重组，重组的DNA称为重组体或重组子。研究中需要克隆或表达的基因为外源DNA，载体是指能够携带外源基因进入受体细胞，并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的工具，其中质粒载体最为常用。
    质粒是独立于细菌染色体外具有自我复制的DNA分子。所有的质粒都有复制子、选择性标志和多克隆位点3个共同的特性。质粒载体的选择包括载体的大小、载体拷贝数、多接头以及筛选插入片段的能力，pcDNA3.1（+/-）是比较常用的真核表达载体。

基本步骤：
    1、目的DNA片段的获得。这一步骤中，可以选择通过设计引物进行PCR扩增来获得目的DNA片段，也可以通过化学合成的方法来获得目的DNA片段，这里值得注意的点，目的DNA片段5'和3'端需要引物合适的酶切位点，方便后续与质粒载体的连接。
    2、目的DNA片段与质粒连接。通过选择的酶切位点将环形的质粒酶切成线性，与目的DNA片段进行连接反应，而后转化至大肠杆菌感受态细胞中，进行培养。
    3、连接产物转化及鉴定。挑选2-3个单克隆置于含有抗性的液体培养基中进行扩大培养。提取质粒进行双酶切鉴定，双酶切后电泳，能够看到存在与目的DNA片段大小一致的条带，说明此单克隆插入了目的DNA片段，而至于目的DNA片段中碱基序列是否存在突变点，需进行一代测序验证。只有同时满足双酶切鉴定大小合适并且测序后DNA碱基序列*一致的单克隆菌才被认定为构建成功的重组子。
    4、鉴定正确的重组质粒扩大培养及保种。将上述构建成功的重组子质粒菌种再一次扩大培养，提取重组子质粒以及进行保种，方便后续实验使用。
    值此，包含此外源DNA的重组DNA的构建算全部完成。

注意事项及心得体会：
    1、目的DNA片段获取过程中，如果选择通过设计引物进行PCR扩增方法来获得，建议选择高保真的酶来进行扩增反应，这样在一定程度上可以降低因为扩增反应而产生的碱基引入错误。
    2、PCR产物和酶切产物尽量不要放置时间过长，最好是即时进行连接。
    3、连接体系中载体与目的基因的分子数比例，需要摸索合适的比例，一般为1:3--1:10，合适的比例能够提高连接效率。