干货分享--WB实验问题总结与处理方案（二）

Western blot实验过程中常见问题汇总及处理方案。

21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？浓缩胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？

答：分离胶用7％，浓缩胶 3.5％，200kd的蛋白不好做。

22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？

答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。

23、蛋白变性后可以存放多久？

答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

24、我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？

答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

26、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？

答：Western Blot一般上样30－100ug不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。

27、做组织样品的western的时候，怎样处理样品？

答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。

28、问大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

29、有什么方法可以提高上样量？

答：a)可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；b)用5倍的上样缓冲液来稀释变性

30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超载。

31、一抗，二抗的比例是否重要？

答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

33、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？

答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

34、Western Blot 中抗体的可以重复应用吗？

答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

35、在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？

答：可以。

37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？

答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。

38、做Western Blot时，同样的抗体免疫组化能做出，而Western Blot却不能？

答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和免疫组化。

39、如果是6×8转印膜，要加多少一抗？

答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。

40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。

答：无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。