逆转录PCR

RT-PCR，逆转录PCR或称反转录PCR（Reverse Transcription PCR），是聚合酶链式反应的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，RNA在逆转录酶的作用下被逆转录成为互补DNA（complementary DNA，cDNA），再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

基本原理：

用逆转录酶以RNA为模板合成与其互补的DNA（cDNA）的过程。因为mRNA末端存在Poly A，所以用Oligo dT作为通用引物与其互补。商品化的反转录试剂盒里通常除了Oligo dT之外，还可以用随机引物，但一般用Oligo dT引物就可以了。

重要参数：

不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同；因此，适合于一种mRNA拷贝的条件可能对另一种mRNA不适合。一般来说，从事不均一mRMA群体时，所使用的条件是导致cDNA合成的终产量达到最大，下述参数十分重要。

1、逆转录酶： 有两种不同的逆转录酶可以催化以mRNA为模板，oligo(dT)作为引物，合成与mRNA互补的cDNA链。一种来自纯化的 AMV，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNA酶H活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。另外，禽源逆转录酶制剂可被能切割DNA的核酸内切酶污染。

另一种是Mo-MLV，是单肽链的，有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37℃，最适pH7.6，较弱的RNA酶H活性对获得2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大好处。在第一链反应前可用氢氧化甲基汞处理，破坏mRNA的二级结构，这一步对于最适反应温度较低(37)℃的鼠源逆转录酶催化的反应可能更为重要。临合成cDNA第一链之前加入过量的巯基试剂，可以使氢氧化甲基汞从RNA上解离。

2、单价阳离子： 离子条件基本上影响各种模板的转录效率。用钾比用钠离子可获得较长的转录产物。对于cDNA长度的最适钾离子浓度为140-150mM。

3、二价阳离子： 对于反转录酶活性来说，二价阳离子是必需的。低于4mM Mg2 未能观察到活性；产生全长转录产物的最适浓度是6-10mM。

4、脱氧核苷三磷酸： 使用四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)中每一种的高浓度对于有效合成cDNA是特别重要的。如果其中只有一种的浓度下降到10-50微摩尔以下，全长转录物的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-250微摩尔。

注意事项：

1、RNA 提取一定要迅速，样本要新鲜，组织尽量在液氮中研磨；

2、RNA 提取完马上进行逆转录不要拖延，新提的RNA很容易降解；

3、逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免模板RNA降解。