培养细胞那些事

   养细胞这件事儿，看似简单，然而却常常因为各种原因，让我们珍贵的实验细胞一再受损或者死亡，今天为大家讲述细胞从复苏、传代到冻存等一系列过程及常遇到的那些你可能忽略的小却重要的细节。

一、细胞的营养来源

针对大多数肿瘤细胞，营养配方一般为：90%合成培养基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS)；为了防止污染，可以加1%双抗！

不同细胞的培养基是不同的。一般ATCC购买的细胞，针对不同细胞株，会有详细介绍，包括生长的状态图、培养基的类型等。培养基一般都是偏红色，因为培养基加了酚红来显示颜色，指示pH范围为6-8，颜色会由黄变为紫红。这是为了我们能更直观观察培养液的变化，如变黄，则代表偏酸，偏碱性了就显示偏紫色。一般来说，细胞吸收营养后，变黄后就暗示我们要换培养基啦！若是细胞生长缓慢或者实验设计需求，是可以增加血清比例的，一般10%-20%的血清比例是比较OK的，也不建议太高的血清比例。

二、细胞的居住环境

舒适无菌的环境是细胞健康生活的重要基础。细胞居住在培养细胞的器皿，包括形状、规格、用途多样的培养瓶、培养皿及培养板中。最终住进37℃，5%CO₂的恒温培养箱。

根据不同实验的目的和用途，可以选择不同规格的培养板或培养皿，如后期要进行流式细胞检测，一般使用 6 孔的细胞培养板来培养细胞，如果湿要进行爬片处理，建议使用 24 孔的细胞培养板，进行MTT实验来检测细胞活力的话，一般用 96 孔板来种植细胞等，如果后期实验需求细胞量大，可以使用大的培养瓶，甚至细胞培养工厂来进行。就细胞培养状态来说，培养瓶和培养皿没有太大区别，主要在于安全系数(培养瓶>培养皿)、培养细胞数量(大培养瓶>培养皿)。但是培养瓶成本也会相对较高，因此无特殊要求，一般选择培养皿即可。

三、细胞的复苏与冻存(原则是慢冻速融)

1. 细胞复苏：指将冻存的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。

复苏过程如下图所示：

有时候会出现细胞复苏后，难以贴壁的情况，这个时候主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。还有一种情况就是细胞贴壁了，却长不起来，这是因为一些细胞倾向于维持一定的密度，可将细胞转移到较小的培养瓶或皿中进行培养。

2. 细胞冻存 将细胞放在低温环境(-70℃~-196℃)，细胞内的代谢降低，可最大限度的保存细胞活力，以便长期储存。

目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂，细胞冻存液的配方有很多种，如培养基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，复苏存活率在80%～90%以上。大部分实验室用细胞冻存盒来进行细胞冻存，如果没有细胞冻存盒，可先将冻存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或过夜，最后放入液氮罐内。为了节约时间，还可直接在冻存盒外包裹一团棉花，用棉花代替冻存盒缓慢降温的特点，将细胞转移至-80℃冰箱过夜，再转移至液氮保存。为了保证细胞复苏后的细胞数量，一般在冻存细胞时每管细胞的浓度应在10⁶—10⁷个/ml/管。

四、细胞的传代培养

细胞传代：细胞在培养过程中不断增殖，培养皿/瓶空间有限，当细胞接触过密，生长就会受到抑制，影响细胞状态，因此我们要把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶里。

Q：为什么我们总说选择对数期细胞传代?

A：细胞的生长和分裂，一般遵循以下模式：停滞期，对数期(指数期)，平稳期(平台期)和衰退期。为了确保活力，遗传稳定性和表型稳定，必须使细胞保持在对数期。

Q：那如何确定细胞对数期?

A：根据上述细胞生长曲线，为了确保活力，必须使细胞保持在对数期就传代，所以一定不能等到细胞长满100%融合时才去消化传代。一般细胞长到 70% -80%左右即可传代。

Q：一般细胞传代都是1分2吗?

A：要根据不同细胞生长速度以及后续实验安排而定，没有固定的必须1分几，常规1分2至1分5都可以。此时我们就要多观察摸索最合适的传代比例。

Q：消化很关键吗?

A：不得不说，细胞状态差，很多时候与传代时胰酶消化密切相关。一般肿瘤细胞消化1-2min即可。但是每一种细胞贴壁能力不同，因此对胰酶的反应也不同，我们需要密切跟踪。一般肉眼观察到贴壁细胞层能移动即可终止;而非细胞全部分散成单个。

Q：部分比较难消化的细胞怎么办?

A：可放于37℃培养箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受细胞为例，放于37℃培养箱消化5-8min，轻轻拍打，才见细胞成片移动，因此针对难消化细胞一定要在显微镜下密切观察。

Q：几天换培养基?

A：正常情况下，培养液偏红色。如果细胞维持在pH6.5～6.6条件下，培养基变黄，说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，细胞会脱落死亡，需要更换新鲜培养液。一般细胞生长旺盛时1～2天换一次，生长缓慢时，3～4天亦可。针对复苏后的细胞，建议隔天换液。

Q：每天观察细胞有必要吗?

A：一般的肿瘤细胞我们是隔天传代，但是切不可忽略对细胞的观察，一定要每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。记住，是每天。

Q：如果细胞形态不清晰或有异物等，如何处理?

A：可以考虑如下操作：首先，倒掉旧的培养基，用新的培养基或者PBS洗涤2-3次，再开始正式的消化、吹打。其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内。后续再密切观察。

Q：细胞污染怎么办?

A：如发现细胞有污染，一般建议丢弃。如果细胞非常宝贵，可试着加入含抗生素的培养基反复清洗，并用抗生素含量高的培养基培养，并经常更换培养基;

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